产品简介：

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素FITC标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

本试剂盒可应用于培养细胞凋亡检测（不推荐用于检测组织样本）。

产品组分：

使用方法:

1、悬浮细胞离心（2000rpm 离心5min）收集；贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集（注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性）；

2、用PBS洗涤细胞二次（2000rpm离心5min）收集1~5×105细胞；

3、加入500uL的Binding Buffer悬浮细胞；

4、加入5uL Annexin V-FITC 混匀后，加入5uL Propidium Iodide，混匀；

5、室温、避光、反应5～15min；

6、请在1h 内，进行下述荧光显微镜或流式细胞仪的观察和检测。

A．荧光显微镜观察

• 滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞；
• 对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；

1、将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组；

2、用PBS洗涤细胞两次；

3、在500uL的Binding Buffer 中加入5uL Annexin V-FITC，5uL Propidium Iodide，混匀；

4、将上述溶液滴加于盖玻片表面，使盖玻片表面均匀覆盖；

5、避光、室温反应5min。

6、将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下、双色滤光片（FITC和罗丹明）观察。Annexin V-FITC 荧光信号呈绿色，PI 荧光信号呈红色。

1. 流式细胞仪分析

1) 用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488 nm；发射波长Em=530 nm。

2) Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道（FL1）检测；PI红色荧光（流式Ex=488nm,Em≥630nm）通过FL2或FL3通道检测，建议使用FL3。

3) 荧光补偿调节：使用经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。

C．实验范例

用凋亡诱导剂诱导 P388 细胞凋亡，在 37℃，5%CO2 培养箱培养4～6h 后，参照说明书的操作方法进行检测， 经流式细胞仪检测结果见下图。

对照                  诱导剂处理

注意事项：

1、微量试剂取用前请离心收集。

2、Annexin V-FITC，Propidium Iodide（PI）避光保存及使用。

3、Propidium Iodide（PI）有毒，操作时要戴手套。

4、本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不以应低1×105，不推荐用于检测组织样本。

5、推荐使用悬浮培养细胞。如果是贴壁细胞，需用不含EDTA的胰酶消化，如消化不当，可能引起假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2%BSA的PBS中，防止进一步的损伤。

6、细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。

7、因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。

8、本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

9、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

保存条件：

2-8℃避光保存，一年有效。