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细胞培养常用的消化液

发布人:Biosharp技术部    浏览 5915 次    时间:2013年3月29日
一、胰蛋白酶(trypsin)溶液
    胰蛋白酶是白色或淡黄色粉末,低温干燥保存。主要作用是使细胞间的蛋白质水解,使细胞离散。其活性以其消化酪蛋白的能力进行测定。常用1:250(1:500)方法表示,即1份胰蛋白酶可以消化250份(或500份)酪蛋白。
胰蛋白酶对细胞的分离作用与细胞的类型和细胞的性质关系密切。不同细胞系对胰蛋白酶溶液的浓度、温度和作用时间等的要求也不相同。
 
    无钙镁离子的平衡盐溶液(常用于配制胰蛋白酶溶液或用于洗涤细胞)
    NaCl    8g
    KCl    0.20g
    KH2PO4    0.02g
    Na2HPO4    0.073g
    葡萄糖    2.00g
    酚红    0.02g
    溶于1000ml水中
    染色体的G带核型实验中胰蛋白酶用生理盐水配制。
   
二、EDTA溶液
    又称versene,一般用其钠盐,因可溶性较好。有些组织需要Ca2+、Mg2+来保持其完整性,用EDTA来排除这些离子,可使细胞之间裂解,以分散细胞。其作用比胰蛋白酶缓和。使用浓度为0.02%,以无钙、镁的平衡盐溶液配制。
    实验室内常将胰蛋白酶和EDTA联合使用。可提高消化效率,细胞分散情况改善。
EDTA不能被血清抑制,所以消化后必须彻底清洗。
EDTA对成纤维细胞作用差。
 
 
三、胶原酶溶液
    1.用Hank's液配制成2000U/ml
    2.36.5度搅拌溶解1h,4度过夜
    3.滤过消毒
    4.分装成等份使用(1-2周内)
    5.长时间贮存在-20度
 
四、贴壁细胞——消化法——细胞悬液
    1.吸除或倒掉瓶内培养液。
    2.以25cm2培养瓶为例,向瓶内加入1ml消化液(胰蛋白酶或与EDTA混合液)轻轻摇动培养瓶,使消化液流遍所有细胞表面,然后吸掉或倒掉消化液后再加1ml消化液,轻轻摇动后再倒掉大部分消化液,仅留少许进行消化。也可不采用上述步骤,直接加1-2ml消化液进行消化,但要注意尽量减少消化液的剩余量,因为消化液过多对细胞有损伤,同时也需要较多的含血清培养液去中和。
    3.消化最好在37度或室温25度环境下进行。消化2-5分钟后把培养瓶放置在显微镜下进行观察,发现胞质回缩、细胞间隙增大后,应立即终止消化。
    4.如仅用胰蛋白酶可直接加含血清的培养液,终止消化。
       如用EDTA消化,需加Hank's液数毫升,轻轻转动培养瓶把残留EDTA消化液冲掉,然后再加培养液,这个操作过程要十分小心,如果细胞已经脱壁则消化液不能够倒掉,以免丢失细胞,要加入Hank's液或培养液终止消化,吹打收集细胞悬液,离心漂洗去除EDTA。
    5.用弯头吸管,吸取瓶内培养液,反复吹打瓶壁细胞,吹打过程要顺序进行,从培养瓶底部一边开始到另一边结束,以确保所有底部都被吹到。吹打时动作要轻柔不要用力过猛,同时尽量不要出现泡沫,这些都对细胞有损伤。细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。
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